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  • 詳細解析鬼筆環肽在行業中的操作步驟
  • 點擊次數:3176 發布時間:2019-09-24
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  •    鬼筆環肽是從一種劇毒磨菇中分離出來的一種多肽物質,屬于毒傘肽類毒素,是一種強烈毒素。C35H48N8O11S。無色,細針狀結晶。分子量788.87g/mol, 熔點281oC.
     
      鬼筆環肽的操作步驟:
      1、工作液準備:
      本品以溶于甲醇的20μM儲存液形式提供,總量為300μl。按照100nM的工作液濃度來換算,可制備總量為60ml的工作液。建議收到產品后,根據單次使用量,對母液進行小量分裝,-20℃避光凍存,一年穩定。開始實驗前,使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為:80~200nM?,F配現用。
     
      2、染色步驟:
      a、細胞爬片生長24h,使其密度達到50%匯合度。
      b、吸掉培養液,37℃預熱的1×PBS(pH7.4)清洗細胞2次。
      c、使用溶于PBS的4%甲醛溶液進行細胞固定,室溫固定10min。
      d、室溫條件下,用PBS清洗細胞2~3次,每次10min。
      e、室溫條件下,用丙酮(≤-20℃)脫水或者用0.5%TritonX-100溶液透化處理5min。
      f、室溫條件下,用PBS清洗細胞2~3次,每次10min。
      g、取200μl配制好的FITC標記鬼筆環肽工作液,覆蓋住蓋玻片上的細胞,室溫避光孵育30min(通常情況下,4℃~37℃孵育皆可)。
      h、用PBS清洗蓋玻片3次,每次5min。
      i、使用200μlDAPI溶液(濃度:100nM)對細胞核進行復染,約30s。
      j、用PBS清洗蓋玻片,然后倒置在已經滴有一滴Fluoromount-GTM水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑,然后用指甲油封片。此法制備的標本玻片可置于4℃避光保存,通常6個月內可繼續做F-actin染色分析。
      k、熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察,選擇FITC激發/發射濾片(Ex/Em=496/516nm)和DAPI激發/發射濾片(Ex/Em=364/454nm)。
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